Nieuws - Monitoring van het zuurstofgehalte in het biofarmaceutische fermentatieproces

Wat is opgeloste zuurstof?

Opgeloste zuurstof (DO) verwijst naar moleculaire zuurstof (O₂)._₂) dat is opgelost in water. Het verschilt van de zuurstofatomen die aanwezig zijn in watermoleculen (H_₂Opgeloste zuurstof (DO) komt in water voor in de vorm van onafhankelijke zuurstofmoleculen, afkomstig uit de atmosfeer of gegenereerd door fotosynthese door waterplanten. De concentratie van DO wordt beïnvloed door diverse factoren, waaronder temperatuur, zoutgehalte, waterstroming en biologische activiteiten. Daarom is het een cruciale indicator voor het beoordelen van de gezondheid en de mate van vervuiling van watermilieu's.

Opgeloste zuurstof speelt een essentiële rol bij het bevorderen van het microbiële metabolisme en beïnvloedt de cellulaire ademhaling, groei en de biosynthese van metabolische producten. Hogere concentraties opgeloste zuurstof zijn echter niet altijd gunstig. Overtollige zuurstof kan leiden tot verdere afbraak van geaccumuleerde producten en mogelijk toxische reacties veroorzaken. De optimale concentratie opgeloste zuurstof (DO) verschilt per bacteriesoort. Tijdens de biosynthese van penicilline wordt de DO bijvoorbeeld doorgaans op ongeveer 30% van de luchtverzadiging gehouden. Als de DO tot nul daalt en gedurende vijf minuten op dat niveau blijft, kan de productvorming aanzienlijk worden belemmerd. Als deze situatie 20 minuten aanhoudt, kan onherstelbare schade optreden.

De meest gebruikte DO-sensoren kunnen momenteel alleen de relatieve luchtverzadiging meten, en niet de absolute concentratie opgeloste zuurstof. Na sterilisatie van het kweekmedium worden belucht en geroerd totdat de sensorwaarde stabiliseert. Op dat moment wordt de waarde ingesteld op 100% luchtverzadiging. Latere metingen tijdens het fermentatieproces zijn gebaseerd op deze referentiewaarde. Absolute DO-waarden kunnen niet worden bepaald met standaard sensoren en vereisen geavanceerdere technieken, zoals polarografie. Luchtverzadigingsmetingen zijn echter over het algemeen voldoende voor het monitoren en controleren van fermentatieprocessen.

Binnen een fermentor kunnen de zuurstofniveaus (DO) variëren in verschillende zones. Zelfs wanneer op een bepaald punt een stabiele waarde wordt gemeten, kunnen er in bepaalde kweekmedia nog steeds schommelingen optreden. Grotere fermentoren vertonen doorgaans grotere ruimtelijke variaties in DO-niveaus, wat de microbiële groei en productiviteit aanzienlijk kan beïnvloeden. Experimenteel onderzoek heeft aangetoond dat, hoewel het gemiddelde DO-niveau 30% kan zijn, de fermentatieprestaties onder fluctuerende omstandigheden aanzienlijk lager zijn dan onder stabiele omstandigheden. Daarom blijft het minimaliseren van ruimtelijke DO-variaties bij de opschaling van fermentoren – naast overwegingen met betrekking tot geometrische en vermogensgelijkvormigheid – een belangrijk onderzoeksdoel.

Waarom is monitoring van opgeloste zuurstof essentieel bij biofarmaceutische fermentatie?

1. Om de optimale groeiomgeving voor micro-organismen of cellen te behouden.
Industriële fermentatie omvat doorgaans aerobe micro-organismen, zoals Escherichia coli en gist, of zoogdiercellen, zoals Chinese Hamster Ovary (CHO)-cellen. Deze cellen fungeren als "werkers" binnen het fermentatiesysteem en hebben zuurstof nodig voor ademhaling en metabolische activiteit. Zuurstof dient als de uiteindelijke elektronenacceptor bij aerobe ademhaling, waardoor energie in de vorm van ATP kan worden geproduceerd. Een onvoldoende zuurstofaanvoer kan leiden tot verstikking van de cellen, groeistagnatie of zelfs celdood, met uiteindelijk als gevolg een mislukte fermentatie. Het monitoren van de zuurstofconcentratie zorgt ervoor dat deze binnen het optimale bereik blijft voor een duurzame celgroei en -levensvatbaarheid.

2. Om een efficiënte synthese van de beoogde producten te garanderen.
Het doel van biofarmaceutische fermentatie is niet alleen het bevorderen van celproliferatie, maar ook het faciliteren van de efficiënte synthese van gewenste eindproducten, zoals insuline, monoklonale antilichamen, vaccins en enzymen. Deze biosynthetische processen vereisen vaak een aanzienlijke energie-input, voornamelijk afkomstig van aerobe ademhaling. Bovendien zijn veel enzymatische systemen die betrokken zijn bij de productsynthese direct afhankelijk van zuurstof. Zuurstofgebrek kan deze processen verstoren of de efficiëntie ervan verminderen.

Bovendien fungeren de zuurstofniveaus als een regulerend signaal. Zowel extreem hoge als extreem lage zuurstofconcentraties kunnen:
- Verander de cellulaire metabolische processen, bijvoorbeeld door over te schakelen van aerobe ademhaling naar minder efficiënte anaerobe fermentatie.
- Activeert cellulaire stressreacties, wat leidt tot de productie van ongewenste bijproducten.
- De expressieniveaus van exogene eiwitten beïnvloeden.

Door de zuurstofniveaus in de verschillende stadia van de fermentatie nauwkeurig te regelen, is het mogelijk het celmetabolisme te sturen naar een maximale synthese van het gewenste product, waardoor een fermentatie met een hoge dichtheid en een hoge opbrengst wordt bereikt.

Inleiding tot het waterstroomschema voor biofarmaceutische producten

3. Om zuurstoftekort of -overschot te voorkomen
Zuurstofgebrek (hypoxie) kan ernstige gevolgen hebben:
- Celgroei en productsynthese stoppen.
- Het metabolisme verschuift naar anaërobe processen, wat resulteert in de ophoping van organische zuren zoals melkzuur en azijnzuur. Deze verlagen de pH van het kweekmedium en kunnen de cellen vergiftigen.
Langdurige zuurstofgebrek kan onherstelbare schade veroorzaken, waarbij het herstel zelfs na herstel van de zuurstofvoorziening onvolledig is.

Een teveel aan zuurstof (oververzadiging) brengt ook risico's met zich mee:
Het kan oxidatieve stress en de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS) veroorzaken, die celmembranen en biomoleculen beschadigen.
- Overmatige beluchting en roering verhogen het energieverbruik en de operationele kosten, wat leidt tot onnodige verspilling van grondstoffen.

4. Als kritische parameter voor realtime monitoring en feedbackcontrole

DO is een realtime, continue en uitgebreide parameter die de interne omstandigheden van het fermentatiesysteem weerspiegelt. Veranderingen in DO-niveaus kunnen op gevoelige wijze verschillende fysiologische en operationele toestanden aangeven:
Snelle celgroei verhoogt het zuurstofverbruik, waardoor het zuurstofgehalte daalt.
- Substraatuitputting of -remming vertraagt de stofwisseling, waardoor het zuurstofverbruik afneemt en het zuurstofgehalte stijgt.
- Besmetting door vreemde micro-organismen verandert het zuurstofverbruikspatroon, wat leidt tot abnormale schommelingen in de opgeloste zuurstofconcentratie en dient als een vroegtijdig waarschuwingssignaal.
- Storingen aan de apparatuur, zoals een defecte roerder, een verstopping in de ventilatieleiding of een vervuild filter, kunnen ook leiden tot afwijkend gedrag van de opgeloste zuurstof (DO).

Door realtime DO-monitoring te integreren in een geautomatiseerd feedbackregelsysteem, kan een nauwkeurige regeling van de DO-niveaus worden bereikt door dynamische aanpassingen van de volgende parameters:
- Roersnelheid: Door de roersnelheid te verhogen, wordt het gas-vloeistofcontact verbeterd doordat luchtbellen worden afgebroken, wat de efficiëntie van de zuurstofoverdracht verhoogt. Dit is de meest gebruikte en effectieve methode.
- Beluchtingssnelheid: Het aanpassen van de stroomsnelheid of de samenstelling van het inlaatgas (bijvoorbeeld het verhogen van het aandeel lucht of zuivere zuurstof).
- Tankdruk: Een verhoogde druk verhoogt de partiële zuurstofdruk, waardoor de oplosbaarheid toeneemt.
- Temperatuur: Verlaging van de temperatuur verhoogt de oplosbaarheid van zuurstof in het kweekmedium.

BOQU's productaanbevelingen voor online monitoring van biologische fermentatie: