Nieuws - Monitoring van opgeloste zuurstofniveaus in het biofarmaceutische fermentatieproces

Wat is opgeloste zuurstof?

Opgeloste zuurstof (DO) verwijst naar moleculaire zuurstof (O_₂) dat in water is opgelost. Het verschilt van de zuurstofatomen in watermoleculen (H_₂O), aangezien het in water voorkomt in de vorm van onafhankelijke zuurstofmoleculen, afkomstig uit de atmosfeer of geproduceerd door fotosynthese door waterplanten. De concentratie van zuurstof wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder temperatuur, zoutgehalte, waterstroming en biologische activiteit. Als zodanig dient het als een kritische indicator voor het beoordelen van de gezondheidstoestand en vervuilingsstatus van aquatische milieus.

Opgeloste zuurstof speelt een cruciale rol bij het bevorderen van het microbiële metabolisme en beïnvloedt de celademhaling, groei en de biosynthese van metabole producten. Hogere niveaus van opgeloste zuurstof zijn echter niet altijd gunstig. Overtollige zuurstof kan leiden tot verdere metabolisatie van geaccumuleerde producten en mogelijk toxische reacties veroorzaken. De optimale zuurstofniveaus variëren per bacteriesoort. Tijdens de biosynthese van penicilline wordt de zuurstofconcentratie bijvoorbeeld doorgaans gehandhaafd op ongeveer 30% luchtverzadiging. Als de zuurstofconcentratie daalt tot nul en gedurende vijf minuten op dat niveau blijft, kan de productvorming aanzienlijk worden belemmerd. Als deze situatie 20 minuten aanhoudt, kan er onherstelbare schade optreden.

Momenteel kunnen de meest gebruikte zuurstofsensoren alleen de relatieve luchtverzadiging meten, in plaats van de absolute concentratie opgeloste zuurstof. Na sterilisatie van het kweekmedium wordt belucht en geroerd totdat de sensorwaarde stabiliseert. Op dat moment wordt de waarde ingesteld op 100% luchtverzadiging. Vervolgmetingen tijdens het fermentatieproces zijn gebaseerd op deze referentiewaarde. Absolute zuurstofwaarden kunnen niet worden bepaald met standaardsensoren en vereisen geavanceerdere technieken, zoals polarografie. Luchtverzadigingsmetingen zijn echter over het algemeen voldoende voor het monitoren en controleren van fermentatieprocessen.

Binnen een fermentor kunnen zuurstofgehaltes variëren tussen verschillende regio's. Zelfs wanneer op een bepaald punt een stabiele waarde wordt verkregen, kunnen er nog steeds fluctuaties optreden in bepaalde kweekmedia. Grotere fermentoren vertonen doorgaans grotere ruimtelijke variaties in zuurstofgehaltes, wat de microbiële groei en productiviteit aanzienlijk kan beïnvloeden. Experimenteel onderzoek heeft aangetoond dat, hoewel het gemiddelde zuurstofgehalte 30% kan bedragen, de fermentatieprestaties onder fluctuerende omstandigheden aanzienlijk lager zijn dan onder stabiele omstandigheden. Daarom blijft het minimaliseren van ruimtelijke zuurstofvariaties een belangrijk onderzoeksdoel bij het opschalen van fermentoren – naast geometrische en vermogensgelijkvormigheid – bij het minimaliseren van ruimtelijke zuurstofvariaties.

Waarom is het monitoren van opgeloste zuurstof essentieel bij biofarmaceutische fermentatie?

1. Om de optimale groeiomgeving voor micro-organismen of cellen te behouden
Bij industriële fermentatie worden doorgaans aerobe micro-organismen, zoals Escherichia coli en gist, of zoogdiercellen, zoals ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO) gebruikt. Deze cellen fungeren als "werksters" in het fermentatiesysteem en hebben zuurstof nodig voor de ademhaling en stofwisseling. Zuurstof fungeert als de terminale elektronenacceptor bij aerobe ademhaling en maakt de productie van energie in de vorm van ATP mogelijk. Onvoldoende zuurstoftoevoer kan leiden tot celverstikking, groeistop of zelfs celdood, wat uiteindelijk resulteert in een mislukte fermentatie. Het monitoren van de zuurstofconcentraties zorgt ervoor dat de zuurstofconcentraties binnen het optimale bereik blijven voor een duurzame celgroei en levensvatbaarheid.

2. Om een efficiënte synthese van doelproducten te garanderen
Het doel van biofarmaceutische fermentatie is niet alleen het bevorderen van celproliferatie, maar ook het faciliteren van de efficiënte synthese van gewenste doelproducten, zoals insuline, monoklonale antilichamen, vaccins en enzymen. Deze biosynthetische routes vereisen vaak een aanzienlijke energie-input, voornamelijk afkomstig van aerobe ademhaling. Bovendien zijn veel enzymatische systemen die betrokken zijn bij de productsynthese direct afhankelijk van zuurstof. Zuurstofgebrek kan de efficiëntie van deze routes verstoren of verminderen.

Bovendien fungeren DO-niveaus als een regulerend signaal. Zowel extreem hoge als lage DO-concentraties kunnen:
- Veranderen de cellulaire stofwisselingsprocessen, bijvoorbeeld door over te schakelen van aerobe ademhaling naar de minder efficiënte anaerobe fermentatie.
- Cellulaire stressreacties veroorzaken, wat leidt tot de productie van ongewenste bijproducten.
- Beïnvloed de expressieniveaus van exogene eiwitten.

Door de DO-niveaus in verschillende stadia van de fermentatie nauwkeurig te controleren, is het mogelijk om het celmetabolisme te sturen in de richting van maximale synthese van het beoogde product. Zo wordt een fermentatie met een hoge dichtheid en opbrengst bereikt.

Inleiding tot het waterstroomschema voor biofarmaceutica

3. Om zuurstoftekort of -overschot te voorkomen
Zuurstoftekort (hypoxie) kan ernstige gevolgen hebben:
- De celgroei en de productsynthese stoppen.
- Het metabolisme verschuift naar anaërobe routes, wat resulteert in de ophoping van organische zuren zoals melkzuur en azijnzuur. Deze verlagen de pH van het kweekmedium en kunnen de cellen vergiftigen.
- Langdurige hypoxie kan onherstelbare schade veroorzaken en het herstel kan onvolledig zijn, zelfs nadat de zuurstoftoevoer is hersteld.

Een teveel aan zuurstof (oververzadiging) brengt ook risico's met zich mee:
- Het kan oxidatieve stress en de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS) veroorzaken, die schade toebrengen aan celmembranen en biomoleculen.
- Overmatige beluchting en beweging verhogen het energieverbruik en de bedrijfskosten, wat leidt tot onnodige verspilling van hulpbronnen.

4. Als kritische parameter voor realtime monitoring en feedbackcontrole

DO is een realtime, continue en uitgebreide parameter die de interne omstandigheden van het fermentatiesysteem weergeeft. Veranderingen in DO-niveaus kunnen op gevoelige wijze verschillende fysiologische en operationele toestanden aangeven:
- Snelle celgroei verhoogt het zuurstofverbruik, waardoor de zuurstofniveaus dalen.
- Substraatuitputting of -remming vertraagt de stofwisseling, waardoor het zuurstofverbruik afneemt en de zuurstofniveaus stijgen.
- Besmetting met vreemde micro-organismen verstoort het zuurstofverbruikpatroon, wat leidt tot abnormale zuurstofschommelingen en dient als een vroeg waarschuwingssignaal.
- Storingen in de apparatuur, zoals een defecte roerder, verstopping van de ventilatiebuis of vervuiling van het filter, kunnen ook leiden tot abnormaal DO-gedrag.

Door realtime DO-bewaking te integreren in een geautomatiseerd feedbackregelsysteem, kan een nauwkeurige regeling van de DO-niveaus worden bereikt via dynamische aanpassingen van de volgende parameters:
- Roersnelheid: Verhoging van de snelheid verbetert het contact tussen gas en vloeistof door bellen te breken, waardoor de zuurstofoverdracht efficiënter wordt. Dit is de meest gebruikte en effectieve methode.
- Beluchtingssnelheid: Het aanpassen van de stroomsnelheid of de samenstelling van het inlaatgas (bijvoorbeeld door het verhogen van het aandeel lucht of zuivere zuurstof).
- Tankdruk: Door de druk te verhogen, stijgt de partiële zuurstofdruk en verbetert zo de oplosbaarheid.
- Temperatuur: Door de temperatuur te verlagen, wordt de zuurstofoplosbaarheid in het kweekmedium vergroot.

Productaanbevelingen van BOQU voor online monitoring van biologische fermentatie: